2.6. Diagnóstico

El diagnóstico de las dermatofitosis requiere un alto índice de sospecha clínica y se corrobora con metodologías convencionales, como la microscopía o los cultivos. Si el diagnóstico es claro (lesiones únicas o escasas, asimétricas, en áreas expuestas, que crecen en pocas semanas, con borde de crecimiento bien definido y curación central e historia de contacto con animales en las lesiones de piel lampiña) y no se dispone de laboratorio diagnóstico se puede ensayar una crema antifúngica convencional. En las lesiones del cuero cabelludo o de las uñas se requiere siempre la confirmación diagnóstica ya que se precisa la identificación del hongo causal para la elección del tipo de tratamiento.

Algunos casos de tiña del cuero cabelludo por especies como M. Audouini, M. Canis y T. Schonleinii emiten fluorescencia verdosa al examen con luz de Wood.

Para la confirmación del diagnóstico es suficiente con el examen directo al microscopio de las escamas obtenidas del raspado del borde de la lesión. El material se coloca sobre un portaobjetos, se sumerge en una gota de hidróxido potásico (KOH) al 10% y se cubre. En las tiñas del cuero cabelludo se examina un pelo depilado y en las onicomicosis un trozo de lámina ungueal y material queratósico subungueal, con KOH al 40%. En pocos minutos se pueden observar las hifas. También se puede recortar la uña y analizarla histológicamente para confirmar la presencia de hifas en la tabla ungueal sin apenas demora, pero esto rara vez se ejecuta en la práctica y, además, no permite una identificación precisa del patógeno. Ahora bien, si se requiere un diagnóstico micológico preciso el gold estándar es el cultivo de las escamas en medio de Saboureaud, con el que se obtienen los resultados al cabo de 3 o 4 semanas de incubación (Rezusta A, 2016). La identificación precisa del agente causal se basa en la morfología de las colonias y de sus conidias.

Ahora bien, los métodos de cultivo convencionales no tienen una sensibilidad muy elevada. Podría mejorar añadiendo desactivadores antifúngicos para eliminar los mohos saprofitos.

Para reducir la demora diagnóstica se han desarrollado métodos alternativos como el Dermatophyte Test Strip usando una cinta adhesiva para recoger las escamas obtenidas de uñas sospechosas. Permite identificar antígenos micóticos por inmunocromatografía, lo que se consigue en un 90% de muestras (Tsunemi Y, 2016), o la espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS). MALDI-TOF MS es una herramienta de diagnóstico rápida, confiable y de alto rendimiento para la identificación de microorganismos. Se decía que era una tecnología que permitía identificar de manera definitiva aislamientos bacterianos y fúngicos en cuestión de minutos con un costo mínimo de los consumibles por muestra en comparación con los métodos de identificación convencionales (Dingle TC, 2013). Se basa en tecnología fundamental para la proteómica y también se utiliza para analizar sangre, líquido cefalorraquídeo y orina, porque permite identificar directamente los microorganismos en estas muestras líquidas sin cultivo o subcultivo previo. Se está combinando con otras tecnologías, como la citometría de flujo, para ampliar el alcance de las aplicaciones clínicas (Tsuchida S, 2020). Sin embargo, en la identificación de dermatofitos, tiene dificultades debido a la falta de una definición clara de las especies para algunos taxones o dentro de algunos complejos de especies. La revisión de los diez estudios publicados entre 2008 y 2015 muestra que la precisión de la identificación basada en espectroscopia de masas MALDI-TOF varió entre el 13,5 y el 100% para los dermatofitos. Esta técnica no se ve afectada por las variaciones en otras condiciones rutinarias del laboratorio clínico, como el tipo de medio de cultivo, el tiempo de incubación y el tipo de instrumento de espectrometría de masas. Siempre que se disponga de una biblioteca de espectros de referencia adecuada para la identificación de dermatofitos, la identificación por espectrometría de masas MALDI-TOF es más económica y ofrece una precisión comparable a la de la secuenciación de ADN. La técnica también representa una alternativa ventajosa a la identificación prolongada y laboriosa de dermatofitos mediante la morfología macroscópica y microscópica en el laboratorio clínico de rutina (L’Ollivier C, 2017). La identificación de aislamientos clínicos con el protocolo MALDI-TOF MS requiere un paso de subcultivo para garantizar una identificación confiable. Pueden pasar días o semanas antes de que aparezca el crecimiento de hongos en un medio sólido. En un estudio, utilizando el protocolo de MS MALDI-TOF en medios líquidos, se obtuvo una tasa global de identificación correcta (RCI) del 62%, en comparación con el 87% para el protocolo basado en cultivos sólidos. Trichophyton tonsurans no se identificó correctamente en todos los aislamientos utilizando cultivos líquidos, con un 88% de los aislamientos identificados erróneamente como Trichophyton interdigitale. El tiempo de respuesta para los aislamientos primarios para los protocolos sólido y líquido fue respectivamente de 11,7 y 11,6 días (sin diferencia significativa entre ambos métodos, p = 0,96). El protocolo de MS MALDI-TOF líquido de nuevo diseño no condujo a un tiempo de respuesta significativamente más corto para la identificación de dermatofitos aislados de infecciones por tinea capitis. El tiempo de respuesta para el método con aislamientos primarios no fue significativamente menor y la tasa de identificación correcta disminuyó notablemente, lo que enfatiza la necesidad de un paso de subcultivo (Lecerf P, 2022).

La demora en el diagnóstico ha acelerado el desarrollo de las técnicas de diagnóstico molecular, que proporcionan un diagnóstico rápido y preciso de las dermatofitosis para instalar la terapia antimicótica apropiada. Se están comenzando a implementar técnicas moleculares, basadas en la secuenciación del espaciador transcrito interno (ITS) u otras regiones genómicas. Se dispone de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional, una PCR en tiempo real, con la que se han obtenido resultados un 20% superiores a los del examen directo al microscopio y del cultivo (Ohst T, 2016) o una PCR de amplio espectro para la identificación de diversas especies de dermatofitos. Amplifica una región específica 18S del rRNA directamente de muestras de escamas de piel, uñas y pelo, aunque proporciona resultados inferiores a los del cultivo, la PCR digital, la fusión de alta resolución (HRM) y metagenómica/secuenciación de próxima generación (mNGS) (Walser M, 2018). Con estos métodos se consigue reducir el tiempo de diagnóstico de 4 semanas a una pocas horas. La PCR es altamente sensible y específica, aunque el rendimiento puede verse afectado por el uso previo o concurrente de antimicóticos. Los ensayos de PCR pueden identificar incluso las mutaciones asociadas con la resistencia a los antimicóticos, infecciones por mohos no Aspergillus e infecciones por hongos endémicos. La HRM es una modalidad de diagnóstico rápida y altamente sensible que puede identificar una amplia gama de patógenos fúngicos, incluso hasta el nivel de especie, pero los ensayos multiplex son limitados y la HRM actualmente no está disponible en la mayoría de los entornos clínicos (Jenks JD, 2023). Con la PCR es posible identificar el agente infeccioso, incluso cuando se obtienen resultados negativos de los cultivos, en menos de 24 horas. Los métodos de PCR varían según los métodos de extracción de ADN, el ADN y los cebadores específicos, y la forma de analizar los productos de PCR. La elección de un método único en un laboratorio es complicado porque los resultados esperados del análisis de muestras de piel y cabello son diferentes de los esperados en casos de onicomicosis. En muestras de piel y cabello, se debe identificar un dermatofito entre aproximadamente una docena de especies posibles. En la onicomicosis, los agentes infecciosos son principalmente Trichophyton rubrum y, en menor medida, Trichophyton interdigitale, pero también mohos insensibles a los tratamientos orales utilizados para dermatofitos, lo que hace obligatoria la identificación de hongos. Los beneficios obtenidos con el uso de métodos de PCR para el análisis rutinario de muestras dermatológicas deben sopesarse con la importancia relativa de obtener un resultado en poco tiempo, el precio de los reactivos y equipos de biología molecular y, especialmente, el tiempo empleado en realizar manipulaciones de laboratorio (Verrier J, 2017). Se realizó un estudio para evaluar el rendimiento de la plataforma Novaplex PCR en tiempo real multiplex (Seegene) en comparación con los métodos micológicos tradicionales, incluido el examen directo y el cultivo. Un total de 312 muestras de uñas, piel y cuero cabelludo recolectadas de pacientes con sospecha de infecciones fúngicas superficiales se sometieron retrospectivamente al ensayo de dermatofitos Novaplex. En general, 170 (54,6%) y 186 (59,6%) muestras dieron positivo para el cultivo de dermatofitos y la PCR de dermatofitos, respectivamente. La concordancia entre la PCR y el cultivo para la detección de dermatofitos fue del 87,2%. Se obtuvieron 158 muestras con cultivo positivo/PCR positivo, 12 muestras con cultivo positivo/PCR negativo y 28 muestras con cultivo negativo/PCR positivo. La sensibilidad de la PCR frente al cultivo varió según el dermatofito diana, desde el 90,5% (Trichophyton mentagrophytes/interdigitale/benhamiae), el 91,2% (Trichophyton rubrum) hasta el 100% (Microsporum spp. y Trichophyton tonsurans). La sensibilidad y la especificidad para el diagnóstico de dermatofitosis fueron del 92,9% y el 96,6% para la PCR, del 86,7% y el 100% para el cultivo, y del 95,4% y el 92,2% para el examen directo y el cultivo combinados, respectivamente. El ensayo de dermatofitos Seegene Novaplex es un sistema automatizado de extracción por PCR en un solo paso, fácil de usar, que ofrece un rendimiento satisfactorio para el diagnóstico de rutina de dermatofitosis en laboratorios clínicos. Sin embargo, no puede reemplazar por completo la micología convencional debido a su incapacidad para detectar infecciones por mohos e identificar dermatofitos a nivel de especie (Harel F, 2024). Existe una creciente necesidad de estandarización de estas metodologías. Se necesitan pruebas moleculares de bajo costo, fáciles de usar, altamente sensibles y específicas que puedan diferenciar entre organismos colonizados y patógenos de diferentes muestras clínicas. Sin embargo, el diagnóstico biológico de la dermatofitosis todavía depende tanto del examen directo como de los cultivos de muestras clínicas apropiadas. En la mayoría de clínicas se sigue realizando el cultivo tradicional.